mRNA工藝技術平臺之mRNA制劑

mRNA疫苗或藥物的生產工藝，主要分為質粒DNA原液制備、mRNA原液制備、mRNA制劑制備三個階段。本文討論第三階段的工藝平臺，也是當前挑戰(zhàn)最大的環(huán)節(jié)。

關鍵的制劑技術突破解決了mRNA的成藥性問題，使其從60年的科研之路走向臨床商業(yè)化應用，并在此次疫苗應用中大放異彩。據公開信息， BNT162b2和mRNA-1273 2021年累計銷售額超過580億美元。

mRNA制劑的主要工藝環(huán)節(jié)包括mRNA的包封/裝載、復合物純化、除菌過濾、無菌灌裝等，如下圖。整個制劑工藝的核心挑戰(zhàn)在于遞送系統(tǒng)的選擇以及mRNA的包封/裝載，其余步驟采用的是現有成熟工藝。以當前最主流的脂質納米顆粒(LNP)載體為例，相關問題，就足夠頭疼。

▲ mRNA制劑生產工藝流程

1.mRNA原液復融

如果mRNA原液經冷凍儲存或運輸，那么其復融工藝是不容忽視的。具體原因和可用復融設備與質粒DNA原液復融類似。需要注意的是，mRNA分子的穩(wěn)定性要遠低于質粒DNA，復融過程中需要注意避免重結晶。

2.mRNA包封/裝載

包封/裝載工藝的基礎是遞送系統(tǒng)的設計開發(fā)。良好設計的遞送系統(tǒng)才能使mRNA分子進入人體后避免被RNA酶降解、被有效遞送至靶點、穿過細胞膜并在胞內釋放。目前主流是采用非病毒遞送系統(tǒng)，包括基于脂質的遞送系統(tǒng)（如核酸脂質體復合物(lipolexes)、陽離子脂質體）、基于聚合物的遞送系統(tǒng)（如polyplexes）、基于脂質和聚合物的遞送系統(tǒng)（如lipopolyplexes）等。

以目前主流的LNP為例，其直徑約100 nm，由多種脂質成分組成。Moderna公布的脂質成分包括可電離陽離子磷脂：中性輔助磷脂：膽固醇：PEG修飾磷脂，摩爾比為50:10:38.5:1.5。如下圖，mRNA（紅色）與離子化的脂質分子帶正電荷的末端結合形成復合物，脂質的疏水端向外與輔助脂質（藍色、綠色、黃色）疏水端結合，形成穩(wěn)定的脂質雙分子層結構。

▲ LNP的成分及mRNA包封結構

mRNA-LNP包封制備的關鍵，除了脂質成分配方外，就是工藝過程的控制了，即如何控制mRNA與脂質成分的接觸和相互作用過程，以形成穩(wěn)定、均一、收率高的mRNA-LNP復合物。公開報道的LNP制備方法有超聲波、剪切、均質（高壓&微射流）、擠出等。

以當前主流的微流控混合技術來說，Pfizer/BioNTech采用的是沖擊式射流混合器，mRNA溶于偏酸性水相，脂質體溶于乙醇，通過高壓使mRNA溶液與脂質體溶液形成兩股射流對沖混合，強烈的湍流使各組分充分混合，同時乙醇相被稀釋，溶液pH變化，脂質體析出形成脂質納米顆粒并與mRNA形成包封復合物。

▲ KNAUER 沖擊式射流混合器

▲ KNAUER LNP包封設備

不同的廠家可能采用不同的微流控混合/擠出技術，尤其是微流道的設計，但通過兩相混合形成包封復合物這一原理是一致的。影響最終產品質量的因素除了兩相溶液自身成分特性、具體微流控混合/擠出技術外，還包括兩相溶液的注入溫度、壓力、流量、比率等。

▲ PreciGenome 兩相混合包封技術

▲ PNI NxGen混合包封技術

mRNA包封/裝載涉及的工藝設備及耗材主要是微流控設備和流路耗材，現有廠家有PNI/Danaher, PreciGenome, Dolomite Microfluidics, 邁安納, 艾特森等。原材料/試劑除mRNA原液外主要是各種脂質體成分，最關鍵、用量也最大的的是陽離子脂質。耗材試劑相關廠家有Polymun, PNI/Danaher, Evonik, 艾偉拓, 西寶生物, 漢方等。

3.超濾純化

mRNA包封后需要純化去除未包封/裝載的mRNA、游離的聚合物或脂質材料，并調整最終復合物濃度、置換溶劑緩沖體系、調節(jié)pH值等，此步驟通常通過超濾/切向流過濾實現，mRNA-LNP復合物被截留，雜質及溶劑被洗濾。

超濾工藝為成熟技術，可選中空纖維或板式膜包，最關鍵的還是根據mRNA-LNP復合物的粒徑選擇合適的截留孔徑。根據最終制劑成品的配方要求，純化后的mRNA-LNP溶液可能還需要進行制劑配液，添加必要的輔料成分，以利于產品的長期穩(wěn)定保存和體內藥效發(fā)揮。超濾和配液相關的設備耗材品牌可見前兩篇。

4.除菌過濾

此步除菌過濾是最終產品無菌保障的關鍵，一般采用0.22μm除菌級過濾器冗余設置，截留細菌等微生物污染物。按照當前的法規(guī)要求，必須要進行使用后濾器完整性檢測以確保最終產品的無菌性。

除菌過濾為現有成熟技術，可用一次性囊式濾器或套筒式濾器，常見材質有聚醚砜（PES）、聚偏二氟乙烯（PVDF）等。在選擇時重點關注材質與產品的兼容性、溶出析出特性、通量及通量的衰減等。常用除菌過濾器品牌可見前兩篇。

5.無菌灌裝

對于無菌注射劑產品，灌裝技術需根據產品包裝容器來選擇。以mRNA疫苗所用西林瓶為例，無菌灌裝過程包括容器和膠塞的準備、灌裝、加塞、軋蓋、燈檢等步驟。

、西林瓶的準備步驟主要是洗瓶、干燥和除菌除熱原，大規(guī)模生產時，行業(yè)常用洗烘灌聯(lián)動線進行連續(xù)化生產。膠塞的準備過程主要是清洗和滅菌，可以在生產前采用清洗機和滅菌柜進行準備或直接采用免洗免滅菌的無熱原膠塞。

▲ 自動化連續(xù)無菌灌裝加塞

由于灌裝過程為開放式操作，無菌污染的控制是最為關鍵的，要考慮到人員、設備、物料、環(huán)境和操作方法等方面，如無菌灌裝、加塞及產品未*密封時的轉移等操作均需要在環(huán)境進行。

灌裝線常見的品牌包括Syntegon, B+S, IMA, Optima, Romaco/楚天, ROTA/奧星, 東富龍等。隨著一次性使用系統(tǒng)的廣泛應用，灌裝機廠家開始與耗材廠家合作推出一次性灌裝系統(tǒng)，如Syntegon與Sartorius推出的PreVAS, 一次性使用耗材廠家也能提供灌裝耗材定制服務，如Pall, Merck, Avantor, Meissner, 樂純等。

6.包裝儲存運輸

完成灌裝和質檢的mRNA制劑產品，根據儲存運輸要求被冷凍至儲存溫度，之后完成運輸包裝以便于全球流通。對于需要冷凍儲存的mRNA產品，有必要在儲存和運輸過程進行持續(xù)的溫度監(jiān)測，以證明其始終處于規(guī)定的儲存溫度范圍，否則不能保證最終患者給藥時產品的安全性和有效性。

▲ mRNA疫苗成品進行冷凍儲存

雖然mRNA疫苗仍是當前上市的mRNA產品，然而理論上通過mRNA可以編碼任何人類需要的蛋白，不論是作為疫苗還是治療性藥物。Moderna公開的在研管線就包括了預防性疫苗、全身性細胞內治療、局部再生療法、全身性分泌和細胞表面治療、癌癥疫苗、腫瘤內免疫腫瘤治療等。

據 Nature 2021年9月份的綜述預測，mRNA疫苗在mRNA藥物市場的占比將隨著更多mRNA產品獲批上市而逐年下降，10年后將低于50%，更多mRNA產品將得以應用。

▲ mRNA產品市場演變預測
我國《“十四五"醫(yī)藥工業(yè)發(fā)展規(guī)劃》明確提出加快核酸疫苗技術平臺建立，推動相關產品的開發(fā)和產業(yè)化，支持疫苗企業(yè)和重要原輔料、耗材、生產設備、包裝材料企業(yè)協(xié)作，提高各類產品質量技術水平。可見mRNA技術平臺是一定要突破的。

整個mRNA制劑工藝流程中，核心挑戰(zhàn)在于遞送系統(tǒng)的設計和包封工藝，其余部分采用的是現有成熟技術。由于mRNA遞送技術當前仍處于不斷摸索和更新中，未來仍有很多可變性和提升空間，目前仍很難將其稱作平臺工藝，相信隨著更多研究和應用數據的積累，遞送技術平臺將逐步完善。另一方面，mRNA-LNP配方體系仍需要優(yōu)化以提升制劑產品的穩(wěn)定性，降低對冷凍儲存和運輸的要求，從而更利于mRNA產品的流通和臨床應用。

此文對mRNA制劑工藝平臺進行梳理的目的，在于讓同行更為了解整個工藝平臺及現有資源，以便于提升自身的工作效率；同時，讓更多同行了解國內與國際品牌在工藝平臺能力上的差距，看到努力的方向。

文章內容僅基于筆者的知識經驗、信息梳理和總結，可能存在錯誤或疏漏，還請廣大讀者批評指正，歡迎留言評論更正或補充，感謝！

注：部分參考信息、圖片和視頻來源于網絡。

參考文獻

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